类器官（Organoids）是通过干细胞或多能干细胞培养分化形成的三维结构，能够在一定程度上模拟真实器官的结构和功能。判断类器官是否成熟并在适当的时候进行传代，是确保类器官实验顺利进行的重要环节。本文将分享类器官成熟的判断标准及传代流程。

一、判断类器官成熟的标志

1. 形态学观察

类器官的成熟标志包括其大小和形状：成熟的类器官通常呈现均匀的大小和规则的形状。不同类型的类器官具有特定的形态特征，例如，肠道类器官通常呈现囊状结构，而脑类器官可能呈现神经球状结构。一般而言，肠道类器官在培养第12-14天时即可传代。此外，成熟的类器官应展示出与真实器官相似的分层或分区结构，如肠类器官的隐窝-绒毛结构或脑类器官的皮层样分层。

2. 细胞组成

成熟的类器官应包含多种细胞类型。例如，在肠道类器官中应有肠上皮细胞、杯状细胞及潘氏细胞等。细胞组成可通过免疫荧光染色或流式细胞术检测特定细胞标志物来评估。成熟的类器官细胞应完成分化并表达相关的成熟细胞标志物，比如肠类器官中的Villin和脑类器官中的NeuN。可以通过蛋白质免疫印迹（WB）检测这些生物标志物的表达。

3. 功能检测

成熟类器官的功能检测试包括：分泌功能，例如肠道类器官需具备分泌黏液的能力，胰腺类器官需能分泌胰岛素；电生理活性，对于神经类器官，可通过膜片钳等技术检测神经元的电生理活性；代谢活性，包括ATP生成和氧气消耗率。此外，还需检测类器官是否具备预期功能，例如肠类器官的CFTR活性以及心脏类器官的自主跳动能力。

4. 基因表达分析

通过qPCR或RNA测序评估类器官中与成熟相关基因的表达水平，如肠类器官中的分化标志物及脑类器官中的神经元特异性基因。同时，通过检测类器官的DNA甲基化或染色质状态，判定其基因组是否接近体内成熟组织的状态。

二、类器官传代流程

1. 判断何时进行传代

传代时机的判断主要基于类器官的生长速率，当类器官直径达到200-500μm或者生长速度明显减缓时，通常需要进行传代。此外，若培养基变黄或类器官结构开始变得不规则及出现中心坏死，这都表明需要尽快传代。

2. 传代步骤

收集类器官时，轻轻用移液器将其从基质胶中释放并转移至离心管中。接着，加入适量的消化酶，将类器官轻轻吹打解离为小细胞团或单细胞，消化时间通常为5-15分钟，根据类器官类型及消化酶浓度进行调整。随后，加入含血清的培养基以终止消化反应，轻轻吹打使细胞团分散均匀。接下来，以300-500g的速度离心5分钟，去除上清液，用新鲜培养基重悬细胞团，并与基质胶混合，接种到预热的培养板中。待基质胶凝固后，加入类器官培养基，最后将培养板放回37°C、5%CO₂培养箱中继续培养。

注意事项

在传代过程中，需控制消化时间，避免过长导致细胞损伤或过短导致类器官解离不完全。同时，应确保基质胶的高品质并均匀分布。此外，根据类器官类型选择合适的培养基成分，如Wnt、R-spondin、EGF等，以保证类器官正常分化。最重要的是，严格执行无菌操作，避免类器官的污染。

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