ELISA（酶联接免疫吸附剂测定，Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种先进的生物医疗检测技术，继免疫荧光和放射免疫技术之后发展而来。ELISA主要用于检测抗原或抗体的浓度，其显色反应是整个实验的关键步骤，涉及到酶催化无色底物变成有色产物的过程。反应的温度和时间因素对显色强度具有重要影响，在特定的时间内，阴性孔保持无色，而阳性孔在时间延长下显色加深。提升温度通常有助于加速显色。在定量分析中，底物的反应温度和时间需严格遵循标准，而定性分析则可在室温下进行，时间灵活，可依据对照孔的显色情况调整判断。

在使用OPD底物时，显色通常在室温或37℃环境下，反应20到30分钟后达到稳定，不再加深。若反应时间延长，可能导致底值上升。OPD底物在光照下会变色，因此显色反应应避免光照，并在反应结束时添加终止液。OPD产物经硫酸终止后，颜色由橙黄色转变为棕黄色。另一种底物TMB较少受光照影响，可以在室温下进行反应观察，但为了保证结果的稳定性，建议在规定时间内读取结果。TMB经过HRP作用会在约40分钟内显色，之后逐渐减弱，至2小时后几乎无色。多种终止液可用于TMB反应，比如叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS），这些酶抑制剂不仅能迅速终止反应，还能够延长蓝色显色的保持时间，为目视判断提供更好的选择。

在检测过程中，待测标本（其中的抗原）会与固相载体表面的抗体发生反应。经过洗涤后，加入酶标记抗体，通过反应结合到固相载体上。一旦底物加入，酶催化底物生成的有色产物的量与标本中目标物质的量成正比，可通过颜色深浅进行定性或定量分析。ELISA是生物医学研究中广泛使用的实验方法之一，但在实验过程中可能面临各种问题。

ELISA实验中标曲和样本显色问题的分析

尊龙凯时的ELISA实验中，常见的问题包括：

一、标曲不显色或显色很弱

若此情况发生，可能是样本标准品未充分溶解或倍比稀释未涡旋震荡。标准品在溶解和稀释时需充分涡旋，以确保完全溶解和混匀，单靠移液器的反复吹打效果有限。

二、标曲和样本均不显色

在孵育阶段，如果标本静置在桌面上，难以促使抗原与抗体充分接触，可能导致显色偏弱。推荐使用ELISA专用的微孔板振荡器以提高结合效果。此外，漏加组分（如检测抗体、酶等）也可能导致此问题，新手应注意记录和标记。

三、标曲显色，样本不显色

许多人将此情况归因于试剂盒问题，实际上这可能是由于目标蛋白浓度过低或样本中的干扰因素影响。虽然ELISA是检测蛋白质灵敏度最高的方法，但某些情况下仍可能无法检测到目标蛋白。此外，使用高敏ELISA可能提升测量的可能性，但并不一定能够发现样本浓度。

四、标曲和样本都显色，但复孔的CV较大

此问题与移液器的使用及实验者的操作习惯紧密相关。若移液器维护不当，将造成较大的移液误差。提高移液的精准度和一致性是改善CV的关键。

总的来说，ELISA是一项重要的实验技术，尤其是在生物医学研究中，它提供了敏感且可靠的检测手段，尤其是在使用尊龙凯时的相关产品时，充分了解并解决实验中可能遇到的问题，能够显著提高实验结果的准确性和可靠性。