CRISPR/Cas9基因编辑技术正深刻改变着生物医学领域。通过对基因进行敲除、敲入及调控转录活性，这项技术已被广泛应用于研究细胞和动物模型中的基因功能、改良农作物基因，甚至是开发针对人类致病基因的基因疗法。CRISPR基因编辑的组成部分可以通过多种方法，包括病毒和非病毒的形式，递送至目标细胞。各种递送方法各有优缺点，本文将比较多种非病毒基因递送系统的特点，并总结其在不同实验类型中的关键应用要点。

质粒DNA递送系统

质粒DNA递送是引入外源遗传物质的方法中最简单且成本最低的一种，通常通过直接转染质粒DNA。质粒载体能够同时携带Cas9核酸酶和gRNA的编码序列，或者使用两个载体分别携带这两种成分。基于DNA的稳定性，质粒递送可以实现较长期且稳定的转基因表达。特别是在靶点位于高级染色质结构中时，持续的CRISPR组件表达有助于逐步到达这些靶点。然而，长时间的Cas9表达也可能提高非靶位点的切割风险，从而引发显著的脱靶效应。

为了降低脱靶效应，使用质粒递送系统时应考虑在Cas9上引入附加修饰，比如偶联降解信号序列或活性抑制结构域，或采用诱导表达系统。常见的诱导表达系统如四环素响应元件（TRE）可以激活Cas9表达，确保在需要时精准控制基因编辑。质粒的生产相对简单，但具有内毒素污染风险，并且某些为细菌扩增而设计的序列可能引发不必要的免疫反应。为了改善安全性，可以考虑使用微环质粒DNA骨架，如miniVec®。

RNA递送系统

RNA递送系统通过以RNA形式（如Cas9 mRNA和gRNA）递送CRISPR组件，这种方法较质粒递送更为高效，能够绕过转录过程，直接在细胞质中启动翻译。这种递送方式特别适合短期实验，因为RNA的不稳定性导致其在宿主体内迅速降解，从而限制了CRISPR组件的表达时间，降低了脱靶效应，因此被认为相对于质粒递送方式更为安全。然而，RNA的生产成本较高且技术复杂，其大规模生产也面临挑战。

类似于质粒DNA，mRNA可以通过显微注射、电穿孔或脂质纳米颗粒（LNP）进行细胞递送。基于LNP的递送体系在治疗性RNA中已显示出良好效果，例如辉瑞和莫德纳的COVID-19疫苗便采用了这种方法。随着利用mRNA LNP的CRISPR疗法在临床中取得进展，我们期待未来针对治疗甲状腺素淀粉样变性（ATTR）的新突破。

核糖核蛋白复合体（RNP）递送系统

在所有非病毒递送方法中，使用核糖核蛋白复合体（RNP）是递送CRISPR组分效率最高的方法。由于无需转录和翻译，Cas9蛋白和gRNA能够迅速进入细胞核并启动基因编辑。这种方法的表达时间短，有助于减少脱靶效应，并消除了外源基因整合的风险。尽管RNP在稳定性上较差，易被蛋白酶降解，但仍然是一个有效的选择，尤其是在体外基因编辑和小鼠胚胎基因工程中。

电穿孔是有效递送RNP的方式之一，同时通过静脉注射LNP递送RNP在靶向递送上效果显著。基于RNP的CRISPR疗法在临床上已取得成功，首个基于CRISPR基因编辑的药物尊龙凯时Casgevy获得了FDA批准用于治疗镰状细胞贫血。这一创新疗法通过电穿孔将RNP形式的CRISPR组分递送至患者细胞，随后对这些编辑过的细胞进行筛选与回输，为基因治疗开辟了新路径。